میکروسکوپ فلورسانس چیست؟

میکروسکوپ فلورسانس از میکروسکوپ‌های نوری است که منبع نور در آن پرتوهای فرابنفش است. بررسی نمونه‌ها در این میکروسکوپ‌ها با استفاده از نشاندار کردن بخش‌هایی از نمونه با رنگ‌های فلورسانس انجام می‌گیرد. مواد فلورسانس نور را در طول موج فرابنفش جذب می‌کنند و در طول موج بلندتری در طیف مرئی تابش می‌کنند. در نهایت تصویرحاصل، توسط نور بازتاب شده از نمونه ایجاد می‌شود.

میکروسکوپ فلورسانس چیست؟

میکروسکوپ معمولی از نور مرئی (400-700 نانومتر) برای روشنایی و تولید تصویری با بزرگنمایی از یک نمونه استفاده می‌کند. در حالی که، میکروسکوپ فلورسانس منبع نوری با شدت بسیار بالاتر (نور فرابنفش) را به کار می‌گیرد که بخش‌های فلورسنت را در نمونه مورد نظر تحریک می‌کند. این بخش‌های فلورسنت به نوبه خود بازتابی با انرژی کمتر و با طول موجی بلندتر از خود ساطع می‌کند که در این حالت تصویری با بزرگنمایی مناسب از نمونه ایجاد می‌شود.

میکروسکوپ فلورسانس

میکروسکوپ فلورسانس اغلب برای تصویربرداری از ویژگی‌های خاص نمونه‌های کوچک مانند میکروب‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. همچنین این میکروسکوپ برای تقویت بصری ویژگی‌های 3 بعدی در مقیاس‌های کوچک به کار می‌رود. این امر می‌تواند با اتصال برچسب‌های فلورسنت به آنتی‌بادی (نشاندار کردن) که به نوبه خود به ساختارهای ویژه‌ای از نمونه متصل شده‌اند و یا با رنگ آمیزی با روشی کمتر اختصاصی، انجام ‌شود. هنگامی‌که نور پس زمینه منعکس شده در این نوع میکروسکوپ فیلتر می‌شود، قسمت‌های نشاندار شده از یک نمونه معین قابل تصویربرداری است. این ویژگی به محققان توانایی مشاهده اندامک‌های مورد نظر یا ویژگی‌های منحصر به فرد سطح نمونه مورد بررسی را می‌دهد.

میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال اغلب برای برجسته کردن ماهیت 3 بعدی نمونه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این حالت با استفاده از منابع نوری قدرتمند، مانند لیزرها می‌توان بر روی یک نقطه مشخص از نمونه تمرکز کرد. این تمرکز یا فوکوس به طور مکرر در نقاط مختلف در سراسر سطح نمونه انجام می‌شود. بیشتر اوقات یک برنامه بازسازی تصویر، داده‌های تصویری سطح‌های مختلف نمونه را در کنار هم قرار می‌دهد و تصویر سه بعدی از تمام نمونه بدست می‌آید.

میکروسکوپ فلورسانس چگونه کار می‌کند؟

در بیشتر موارد، نمونه مورد بررسی با ماده فلورسنت یا فلوئوروفور نشاندار می‌شود و سپس از طریق عدسی با منبع نوری انرژی بالا مورد تابش قرار می‌گیرد. این نور توسط فلوئوروفورها (که اکنون به نمونه متصل است) جذب شده و باعث می‌شود که آن‌ها نور را با انرژی کمتر و طول موج بیشتر بازتاب کنند. این نور فلورسنت با استفاده از فلیترهایی که برای طول موج خاص طراحی شده‌اند، جدا می‌شوند و به بیننده اجازه می‌دهد تا تنها آنچه که دارای فلورسانس است را ببیند.

وظیفه اصلی میکروسکوپ فلورسانس این است که اجازه می‌دهد، پرتو نور بر نمونه مورد نظر بتابد و سپس نور بازتاب شده از نمونه با انرژی کمتر را جمع‌آوری کند. میکروسکوپ فیلتری دارد که فقط اجازه تابش پرتویی خاص با طول موج مشخصی که با ماده فلورسانس مورد استفاده مطابقت دارد را می‌دهد. تابش این اشعه با اتم‌های درون نمونه برخورد کرده و الکترون‌های موجود در آن را برانگیخته می‌کند و به سطح انرژی بالاتر می‌برد. زمانی که این الکترون‌ها به حالت استراحت برمی‌گردند، به سطح پایین‌تری از انرژی می‌رسند و از خود نور ساطع می‌کنند. برای قابل تشخیص شدن این نور (قابل مشاهده برای چشم انسان)، فلورسانس ساطع شده از نمونه، از یک نور تحریکی روشن‌تر در فیلتر دوم جدا می‌شود. این کار به این دلیل انجام می‌شود که نور ساطع شده دارای طول موج بلندتر و انرژی کمتری نسبت به نور روشن کننده سطح است.

امروزه بیشتر میکروسکوپ‌های فلورسانس مورد استفاده در زیست شناسی، میکروسکوپ‌های اپی‌فلورسانس هستند، به این معنی که هم تحریک و هم مشاهده فلورسانس در قسمت بالای نمونه اتفاق می‌افتد. بیشتر آن‌ها از لامپ تخلیه قوس زنون یا مرکوری برای منبع نور قوی‌تر استفاده می‌کنند.

نحوه آماده سازی نمونه

نحوه آماده سازی نمونه برای مشاهده با میکروسکوپ فلورسانس برای نمونه‌ها مختلف متفاوت است که در زیر به برخی از آن‌ها اشاره می‌کنیم.

تهیه نمونه با ایمونوفلورسانس

تکنیک ایمونوفلورسانس در نمونه سلول‌های ثابت مورد استفاده قرار می‌گیرد که از توانایی‌های ویژه اتصال آنتی‌بادی و آنتی‌ژن در آن استفاده می‌کند. یک آنتی‌بادی خاص، به عنوان یک آنتی بادی اولیه، به پروتئین مشخصی متصل می‌شود. دو نوع روش ایمونوفلورسانس وجود دارد:

ایمونوفلورسانس مستقیم که در آن آنتی‌بادی اولیه مستقیماً به یک فلوروفور وصل می‌شود.

ایمونوفلورسانس غیرمستقیم که در آن آنتی‌بادی اولیه به یک آنتی ‌بادی ثانویه فلورسنت متصل می‌شود که نور را منتشر و محل پروتئین را تعیین می‌کند.

ایمونوفلورسانس مستقیم سریعتر از روش غیرمستقیم انجام می‌گیرد، زیرا مراحل شستشوی و انکوباسیون که در روش غیرمستقیم وجود دارد، در روش مستقیم لازم نیست. با این حال، روش غیرمستقیم انعطاف‌پذیری بیشتری را فراهم می‌کند، زیرا آنتی‌بادی ثانویه فلورسنت می‌تواند با آنتی‌بادی‌های مختلف اولیه ترکیب شود. ایمونوفلورسانس را نمی‌توان در تصویربرداری از سلول‌های زنده استفاده کرد. با توجه به نیاز به آنتی‌بادی‌های ویژه پروتئین مورد نظر کاربرد میکروسکوپ فلورسانس محدود می‌شود.

تهیه نمونه با پروتئین های فلورسنت (پروتئین های فلورسنت سبز)

برای سلول‌های زنده، پروتئین‌ها می‌توانند به صورت ژنتیکی اصلاح شوند تا یک گزارشگر پروتئین فلورسنت داشته باشند. پروتئین‌های فلورسنت سبز (GFPs) گرفته شده از چتر دریایی«Aequorea Victoria» به عنوان یک برچسب فلورسنت برای تصویربرداری از پروتئین‌ها در سلول‌ها استفاده می‌شوند. تاکنون با استفاده از مهندسی ژنتیک چندین پروتئین فلورسانس جهش یافته (FP) درخشان، پایدار و متنوع تولید شده‌اند.

تنوع طیفی این پروتئین‌های فلورسانس جهش یافته بدان معنی است که تصویربرداری همزمان چندین پروتئین در یک سلول قابل انجام است. از این پروتئین‌ها برای سایر تکنیک‌های تصویربرداری از سلول‌های زنده نیز استفاده شده است. ژن پروتئین‌های فلورسنت سبز درون DNA گنجانده شده که پروتئین‌های مورد مطالعه را کد می‌کنند. از آنجا که رونویسی و ترجمه این ژن‌ها هم توسط سیستم سلولی کنترل می‌شود، بنابراین هنگامی که ژن در آن ناحیه از DNA بیان شود؛ ژن پروتئین‌های فلورسنت سبز همزمان بیان شده و پروتئین‌های نشانداری تولید می‌شوند.

تهیه نمونه با پروتئین‌های فلورسنت (آنزیم‌های نشاندار)

روش دیگر نشان‌دار کردن پروتئین‌‌ها از طریق آنزیم‌های خود نشاندار به نام نشانگرهای Halo یا نشانگرهای SNAP / CLIP است. آنزیم‌های خود نشاندار می‌توانند به صورت کووالانسی به یک لیگاند فلورسنت از قسمت باقیمانده اسید آمینه آن بچسبند که اندازه‌ای مشابه با پروتئین‌های فلورسانس دارند. پروتئین‌های بیان شده از این نوع ذاتاً فلورسنت نیستند و فقط زمانی که در معرض فلورسانس قرار می‌گیرند، پرتوهای فلورسانس از خود ساطع می‌کنند. در مقایسه با نشاندار کردن پروتئین‌های فلورسانس، این روش از مزیت امکان نشاندار کردن‌های پی در پی برخوردار است. از تکنیک آنزیم‌های نشاندار برای بررسی فرآیند سلولی در طول زمان نیز استفاده می‌شود. استفاده از آنزیم‌های نشاندار همچنین مکان ردیابی جمعیت پروتئین‌های مختلف را طی یک دوره زمانی فراهم می‌کند.

برنامه‌های کاربردی

تغییرات میکروسکوپ‌های اپی فلورسنت و ظهور منابع نور متمرکز قدرتمندتر مانند لیزرها در آن‌ها، باعث شده است که میکروسکوپ‌هایی با تکنیک‌های پیشرفته‌تر نظیر «میکروسکوپ‌های اسکن لیزری کانفوکال» (Laser Scanning Microscopes )و «میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کل» (TIRF) به دست بیایند.

از میکروسکوپ‌های فلورسانت برای موارد زیر استفاده می‌شود:

تصویربرداری از اجزای ساختاری نمونه‌های کوچک مانند سلول

انجام مطالعات زیست پذیری در مورد جمعیت‌های سلولی

تصویربرداری از مواد ژنتیکی درون سلول (DNA و RNA)

مشاهده سلول‌های خاص در یک جمعیت بزرگتر با تکنیک‌هایی مانند FISH

میکروسکوپ المپیوس

شرکت المپیوس (Olympus) ژاپن یکی از مهم‌ترین‌ شرکت‌های پیشرو در تولید میکروسکوپ‌های بیولوژی و پزشکی به شمار می‌آید. این شرکت با بیش از ۱۰۰ سال تجربه تولید انواع میکروسکوپ، قادر به ارائه راه‌های حل‌های نوری و اپتیکی نوین در جهت پیشبرد انواع برنامه‌ها و پروژه‌های تحقیقاتی است. میکروسکوپ‌های المپیوس در انواع مختلف برای کاربردهای آموزشی و دانشگاهی، آزمایشگاهی و تحقیقات پیشرفته در زمینه‌های مختلف زیست شناسی مانند آسیب شناسی و سیتولوژی دردسترس پژوهشگران قرار دارد.